免疫印迹实验流程

免疫印迹实验流程

A. 溶液和试剂

注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1. 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS)

2. 1X Tris 盐缓冲液 (TBS)

3. 4X SDS 样品缓冲液

4. 1X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液

5. 1X Tris-Glycine 转移缓冲液脱脂奶粉

6. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST

7. 洗涤缓冲液：1X TBST。

8. 一抗稀释缓冲液： 5% 脱脂奶粉的 1X TBST

9. Prestained Protein Marker, Broad Range (10-180 kDa)(30-300 kDa)

10.印迹膜和纸

11.HRP 偶联二抗

12.检测试剂：ECL 化学发光检测试剂盒

 

B. 蛋白质印迹制备样品的常规流程。

样品制备、SDS-PAGE 和转移

1. 收集细胞，3000 转/分钟，离心 5 分钟，弃上清。用 1X PBS 洗涤细胞一次。

2. 加入冰预冷的裂解液,放入冰水混合物的烧杯中 1.2"/5"×5 次超声。

3. 加入 4X SDS 样品缓冲液，在沸水中煮 5 分钟，放在冰上冷却。

4. 上样 30 μg 到 SDS-PAGE 凝胶上。

5. 电转移至 PVDF 膜上 。

 

C. 膜封闭和抗体孵育封闭和抗体孵育

I. 膜封闭转移之后，将膜置于 25 mL 封闭缓冲液中，在室温下孵育 2 小时。

II. 一抗、二抗孵育

1. 将膜和一抗（按照产品说明书中建议的适当稀释度和稀释液）置于 6 mL 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2. 用 TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

3. 按一抗来源选取合适的 HRP 偶联的二抗，置于 6 mL 封闭缓冲液中在摇床上孵育2 小时。

4. 用 TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

5. 继续进行检测（D 部分）。

D. 蛋白质检测

将洗涤后的膜放置在 Fluor Chem E 显色板上，将混合好的 A,B 液均匀的涂抹于膜上,将显色板放入仪器中曝光，读取数据。