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原文链接：https://doi.org/10.1038/s41392-026-03039-y（点击阅读原文可查看完整文章）
近日，国际知名期刊《Signal Transduction and Targeted Therapy》在线发表了一项关于结直肠癌肝转移肿瘤免疫微环境的重磅研究成果，题为 Histone H4K5 lactylation-driven feedback loop modulates glycerol-linked immunosuppressive activity of tumor-associated T regulatory cells。
该研究深入解析了结直肠癌肝转移病灶中肿瘤浸润调节性 T 细胞（TI-Tregs）的细胞异质性，揭示甘油代谢-组蛋白 H4K5 乳酸化介导的正反馈环路，阐明转移灶 Treg 获得超强免疫抑制功能的核心分子机制。本研究中，ProteanFect?Max 转染试剂助力科研团队完成原代 Treg 细胞 siRNA 敲低关键功能实验，为该机制发现提供重要实验支撑。
关键需求：原代 Treg 属于难转染的敏感免疫细胞，研究需要高效递送 siRNA，敲低甘油激酶 GK，以此证实 GK-乳酸-组蛋白乳酸化轴在 Treg 代谢重编程、免疫抑制功能中的因果作用。
实验方法：采用ProteanFect?Max转染试剂递送体系，将 GK-siRNA高效转染至小鼠原代 Treg 细胞，实现靶基因 GK 特异性沉默。
助力关键发现：高效沉默 GK 基因，明确 GK 缺失会直接破坏组蛋白 H4K5 乳酸化修饰，削弱 Treg 免疫抑制活性，从功能层面证实甘油-H4K5 乳酸化正反馈环路。
结直肠癌（CRC）是全球范围内高发的恶性肿瘤，肝转移是结直肠癌患者死亡最主要的诱因。肝脏具备独特的高甘油营养微环境，会塑造高度免疫抑制的转移生态位，因此结直肠癌肝转移（CRLM）大多表现为 “免疫冷肿瘤”，免疫检查点阻断治疗应答率很低。
肿瘤浸润调节性 T 细胞（TI-Tregs）是肿瘤微环境中介导免疫逃逸的核心细胞群体，可显著抑制机体抗肿瘤免疫应答。近年研究证实，Treg 并非均质细胞群，不同亚群在代谢适应性、表观修饰、免疫抑制能力上存在巨大异质性。乳酸化作为连接代谢与表观遗传的新型翻译后修饰得到广泛关注，但肝脏特有的高甘油营养环境如何通过代谢-表观串扰重塑转移灶 TI-Treg 的功能，驱动肿瘤免疫逃逸，依旧有待深入解析。
因此，亟需解析肝转移病灶中 TI-Treg 的亚群异质性，挖掘代谢-表观调控关键节点，为转移性结直肠癌开发全新免疫联合治疗策略。
本研究旨在整合单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）、空间转录组学、体外细胞功能实验以及体内动物模型，全面绘制结直肠癌肝转移患者原发灶、肝转移灶及对应癌旁组织中 Treg 细胞的高分辨率转录全景。鉴定肝转移灶特异性 TI-Treg 功能亚群，解析甘油代谢-组蛋白 H4K5 乳酸化介导 Treg 免疫抑制的分子环路；阐明甘油激酶 GK 在 Treg 代谢重编程中的核心作用，并评估靶向 Treg 甘油代谢通路联合免疫检查点抑制剂的体内治疗潜力，为结直肠癌肝转移的免疫治疗开辟新靶点。
研究分析 7 对结直肠癌原发肿瘤-癌旁、10 对肝转移灶-癌旁肝脏的单细胞数据集。结果显示，对比癌旁组织，原发灶、肝转移灶中 Treg 浸润水平升高，肝转移灶 Treg 浸润最为显著，且高表达 PDCD1、CTLA4 免疫抑制分子。
GSVA 通路分析证实，仅肝转移灶 Treg 中甘油磷脂代谢、甘油脂代谢通路显著上调；火山图筛选得到甘油激酶 GK，该基因在肝转移来源 Treg 显著上调。GK? Treg 甘油代谢通路活性更高，同时免疫抑制标志物表达更强。 空间转录组显示 GK? Treg 富集在肿瘤-癌旁界面；空间定量证明肝转移灶中 GK? Treg 丰度显著高于原发结直肠癌病灶。
图1.转移微环境中 Treg 增强的抑制功能与甘油激酶表达密切相关
对原发灶、肝转移灶的全部 Treg 做无监督聚类，得到 4 个 Treg 亚群。0 号亚群为肝转移灶优势亚群，免疫抑制相关分子、甘油代谢通路均显著上调。该亚群高表达 GK，且 GK?细胞与 CD177（强抑制 Treg 标志物）空间共定位。
基于 CD177 将 GK? Treg 分为 CD177?GK?与 CD177?GK?两个亚群。CD177?GK? TI-Treg 拥有最强甘油、糖酵解代谢能力，免疫抑制分子表达最高。细胞互作分析表明该亚群和 CXCL12?、SPP1?免疫抑制巨噬细胞存在强细胞通讯，协同构建抑制性微环境。泛队列对比发现，CD177?GK?主要富集在结直肠癌肝转移转移灶。
图2.转移病灶内 CD177?肿瘤浸润 Treg 甘油代谢上调，具备强大抑制活性
分离小鼠、人源 nTreg，体外诱导 iTreg 开展功能实验。Treg 高表达甘油转运通道AQP3；甘油刺激上调 GK 表达、GK 酶活以及产物 Gro3P；抑制 AQP3 则直接削弱甘油摄取与下游代谢。葡萄糖剥夺（模拟肿瘤低糖微环境）进一步提升 Treg 的 GK 表达与甘油代谢活性。
体外 CFSE 抑制实验证明，甘油处理上调 Tim-3、Lag-3，显著增强 Treg 免疫抑制能力，但不影响初始 CD4? T 向 iTreg 的诱导。荷瘤小鼠肿瘤浸润淋巴细胞体外培养验证：甘油刺激上调 Treg 抑制分子，增加 CD8? T 耗竭细胞比例。
图3. 葡萄糖剥夺促进甘油代谢并增强 Treg 的抑制功能
Treg 代谢甘油后生成大量胞内乳酸。LDHA 抑制剂 NaOxa 阻断乳酸生成，可以消除甘油诱导的 GK 上调、Gro3P 积累以及 Treg 抑制功能增强效应，证明乳酸是关键中间信号。甘油处理整体提升 Treg 组蛋白乳酸化，主要上调H3K9、H4K5 乳酸化修饰；使用 p300/CBP 乳酸化抑制剂 A-485，同样逆转甘油诱导的 GK 升高。
利用ProteanFect?Max（PT03）转染试剂向小鼠 iTreg 转染 GK-siRNA 实现 GK 敲低；GK 敲低后，甘油无法诱导 H3K9/H4K5 乳酸化升高，Gro3P 生成受阻，Treg 的甘油依赖的抑制能力显著下降；GK 过表达得到相反表型。证实 GK 是甘油-乳酸-组蛋白乳酸化轴的必需分子。
图4. 乳酸介导的乳酸化调控 Treg 内甘油诱导的代谢重编程
ChIP-PCR、荧光素酶报告、CUT&Tag 测序结果显示：H4K5 乳酸化不直接调控 GK 转录，而是上调 FOXP3 基因表达；H3K9 乳酸化不参与该调控。FOXP3 作为核心转录因子，直接识别并结合 GK 基因启动子的特定区段，驱动 GK 转录。
构建 H4 K5R 突变（消除 K5 乳酸化位点），甘油无法诱导 FOXP3 与 GK 上调。确立完整正反馈环路：甘油代谢产生乳酸→H4K5 乳酸化修饰升高→FOXP3 表达上调→FOXP3 结合 GK 启动子促进 GK 转录→GK 进一步强化甘油代谢、产生更多乳酸；同时 H4K5la 上调 LAG3 等抑制分子。
图5. H4K5 组蛋白乳酸化通过 FOXP3 直接激活 GK 转录，构成甘油驱动放大环路
利用 MCT1 抑制剂 AZD3965（抑制乳酸摄入）、MCT4 抑制剂 VB124（抑制乳酸外排）探究胞外乳酸的作用。阻断 MCT4 介导乳酸外流造成胞内乳酸堆积，放大甘油诱导 H4K5la、GK 表达；MCT1 抑制则显著削弱该通路。
胞外乳酸单独可以提升 H4K5la 与 FOXP3，但不足以充分激活 GK；乳酸与甘油存在协同效应，该协同效应依赖 MCT1 摄取乳酸，也依赖 GK 与 H4K5 乳酸化。说明肿瘤微环境高乳酸会进一步放大 Treg 内部甘油-H4K5la-FOXP3-GK 正反馈环路。
图6. 肿瘤微环境乳酸依靠 MCT1/MCT4 介导的乳酸化放大 Treg 甘油代谢
构建 MC38 结直肠癌荷瘤小鼠，高脂饮食提升体内甘油水平；使用 AQP3 抑制剂 DFP00173 阻断甘油摄取。体内结果：高脂饮食小鼠中，DFP00173 单药具备抗肿瘤效果；DFP00173 联合抗-PD-1 产生显著协同抑瘤效果，降低肿瘤内部 Treg 浸润；普通饲料小鼠无该协同效应。
CD8? T 细胞 AQP3 表达很低，几乎不利用甘油，提示该干预优先靶向 Treg。临床结直肠癌样本验证：高甘油肿瘤含有更多 CD177?GK? TI-Treg，该亚群 GK 酶活、Gro3P、H4K5 乳酸化水平更高。
图7. 靶向 Treg 特异性甘油代谢通路增强抗 PD-1 免疫治疗
对覆盖 20 种肿瘤约 300 例患者的单细胞数据集开展泛癌分析。GK 主要富集表达于 Treg 亚群，集中在 c20_Treg_TNFRSF9、c21_Treg_OAS1（CD177 高表达）亚群。在结直肠癌、胃癌、胆管癌中，Treg 的 GK 表达水平与肿瘤内 Treg 浸润比例呈正相关；GK?CD177? Treg 高表达全套免疫抑制分子。
TCR 测序显示，肝转移灶内 GK? Treg 发生剧烈的克隆筛选，部分转移抗原特异性 TCR 克隆发生超扩增，提示肝脏代谢微环境驱动 Treg 的 TCR 克隆选择。
图8. 泛癌分析：Treg 的 GK 表达和肿瘤微环境 Treg 浸润、功能高度相关
该研究首次系统阐明了结直肠癌肝转移微环境中，由甘油代谢驱动的“甘油-乳酸-H4K5 乳酸化-FOXP3-GK” 代谢-表观偶联正反馈调控环路。
揭示了肝脏特有高甘油微环境如何驯化 CD177?GK? TI-Treg，赋予 Treg 强大代谢适应性与超强免疫抑制能力，填补了结直肠癌肝转移领域，肝脏营养微环境通过表观重编程调控肿瘤浸润 Treg 的认知空白，为理解转移性肿瘤 “免疫冷肿瘤” 形成机制提供全新理论解释。
结直肠癌肝转移多属于免疫冷肿瘤，对免疫检查点抑制剂应答差，临床上缺乏有效的治疗干预靶点。本研究鉴定出 CD177?GK? Treg 这一关键致病细胞亚群，锁定甘油转运蛋白 AQP3 为潜在干预靶点，为临床干预提供全新切入点。
动物模型证实，靶向 AQP3 阻断 Treg 甘油代谢通路联合抗 PD-1 抗体可以产生显著协同抗肿瘤效果，能够降低肿瘤内抑制性 Treg 浸润，为结直肠癌肝转移患者，尤其是肥胖、高脂血症、高甘油背景患者的免疫联合治疗，提供坚实的理论依据与转化研究潜力；同时 CD177?GK?Treg 也有望作为预后分层、疗效预判的潜在生物标志物。
本研究应用 ProteanFect?Max 转染试剂（PT03）递送体系，在原代 iTreg 中高效完成 GK-siRNA 递送与基因沉默，在实现有效基因敲低的同时最大程度保留 Treg 细胞活性与生理抑制表型，完成了环路核心分子 GK 的因果性功能验证。
充分彰显 ProteanFect?系列产品在原代调节性 T 细胞这类难治性免疫细胞的基因干扰、机制基础研究中的卓越技术赋能价值，也为免疫代谢、CGT 细胞治疗相关科研提供可靠工具参考。
